• Document: 1. Grundoperationen der Gentechnik Schneiden von DNA
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1. Grundoperationen der Gentechnik – Schneiden von DNA Eines der wichtigsten Werkzeuge der Gentechnik sind Restriktionsenzyme. Sie dienen sowohl dazu, die DNA aus dem Spenderorganismus in Bruchstücke zu zerlegen, als auch zum Aufschneiden der Transport-DNA, in die die Spender-DNA eingefügt werden soll. Restriktionsenzyme lassen sich aus Bakterien gewinnen, die sich mithilfe dieser Enzyme gegen eingedrungene Fremd-DNA schützen. Die Enzyme zerschneiden beispielsweise die einge- schleuste DNA von Bakteriophagen, sodass sich diese in der Bakterienzelle nicht mehr vermehren können. Wegen dieser Einschränkung oder Restriktion der Phagenvermehrung werden die Enzyme als Restriktionsenzyme bezeichnet. Exakt heißen sie Restriktionsendonucleasen, weil sie DNA nicht vom Ende des Moleküls her, sondern von innen abbauen. Die Benennung der verschiedenen Restriktionsenzyme richtet sich vor allem nach den Bakterien, aus denen sie isoliert wurden: Eco steht zum Beispiel für Escherichia coli, Hae für Haemophilus aegypticus, Hin für Haemophilus influenzae. Weitere Buchstaben bezeichnen den jeweiligen Bakterienstamm. Eine römische Ziffer gibt zusätzlich die zeitliche Reihenfolge ihrer Entdeckung an. Substratspezifität. Restriktionsenzyme sind – wie alle Enzyme –substrat- und wirkspezifisch. Jede Enzymart spaltet die DNA spezifisch an einer bestimmten Schnittstelle, die sie an der DNA- Sequenz erkennt. Diese Erkennungssequenzen zeigen häufig eine spezielle Symmetrie: Die Basensequenz des einen DNA-Strangs entspricht von links nach rechts gelesen der Basenfolge des komplementären Strangs in umgekehrter Lesrichtung. Solche Palindrome gibt es auch in der Sprache: Wörter, die vorwärts und rückwärts gelesen werden können wie STETS, REGALLAGER oder RELIEFPFEILER. Die Bakterien schützen ihre eigene DNA vor den Restriktionsenzymen, indem sie die Erkennungssequenzen durch Methylierung „tarnen". In seltenen Fällen wird die DNA eingedrungender Phagen methyliert, sodass auch diese gegen den Abbau durch Restriktionsenzyme geschützt sind. Wirkspezifität. Restriktionsenzyme spalten die Zucker-Phosphat Bindungen in beiden DNA- Strängen. Dabei schneiden sie stets zwischen den gleichen Nucleotiden. HaeIII schneidet zum Bei- spiel immer zwischen G und C. Da es sich in diesem Fall um komplementäre Basen handelt, liegen die Schnittstellen auf beiden Strängen einander genau gegenüber. Die meisten Enzyme schneiden die DNA-Stränge jedoch versetzt, sodass die Schnitte einige Nucleotide voneinander entfernt liegen. Bei EcoRI sind die Schnittstellen beispielsweise um vier Basenpaare versetzt. Dadurch bleiben nach dem Schnitt einzelsträngige Enden stehen. Da diese Einzelstrangenden zueinander komplementär sind und sich wegen der Basenpaarung wieder zusammenfinden können, werden sie als „klebrige Enden" bezeichnet. Anwendung. Inzwischen sind mehr als 3800 verschiedene Restriktionsenzyme bekannt und über 600 im Handel erhältlich, mit denen man DNA beliebiger Herkunft in Fragmente unterschied- licher Größe zerlegen kann. Da jede DNA, die mit demselben Enzym geschnitten wurde, die gleichen klebrigen Enden aufweist, lassen sich DNA-Bruchstücke verschiedener Organismen mit- einander verknüpfen. Die passenden Einzelstrangenden lagern sich spontan zusammen und werden durch das Enzym DNA-Ligase verbunden. Die für ein Individuum typische Verteilung der Restriktionsschnittstellen auf dem DNA-Molekül ist die Grundlage für den genetischen Fingerabdruck. Aufgabe: Notieren Sie sich 10 Stichpunkte, mit deren Hilfe Sie anschließend ihr Thema den anderen Gruppenmitgliedern vorstellen. 2. Grundoperationen der Gentechnik: Übertragen von DNA Rekombinante DNA kann nur dann in Genprodukte umgesetzt werden, wenn sie in eine Wirtszelle gelangt. Für die Übertragung benutzt man häufig Vektoren, DNA-Moleküle, die bestimmte Eigenschaften haben sollten. Vektoren müssen replizierbar sein, das heißt eine Sequenz aufweisen, die als Replikationsursprung dient. Außerdem sollte die Vektor-DNA Markergene enthalten, also zumindest für ein erkennbares Merkmal codieren, sodass sich leicht überprüfen lässt, ob die Übertragung erfolgreich war. Als Vektoren dienen Plasmide und Viren. Inzwischen gibt es aber auch verschiedene Verfahren zur direkten Übertragung von DNA. Plasmide als Vektoren. Die gebräuchlichsten Vektoren für die Genübertragung in Bakterien sind Plasmide. In gentechnischen Verfahren finden häufig konstruierte Plasmide Verwendung, die – entsprechend den Erfordernissen des jeweiligen Versuchs – aus Bestandteilen mehrerer natürlicher Plasmide zusammengebaut werden. Solche Plasmide werden dann nach ihrem Hersteller benannt: pSC101 ist das Plasmid, das STANLEY COHEN bei seinem historischen Experiment benutzte. Ein häufig verwendetes künstliches Plasmid ist pBR322. Es besteht aus einem Plasmid von E. coli mit dem Replikationsursprung, einem Gen für die Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracyclin aus dem Plasmid pSC101 und einem Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin. Beide Resistenzgene

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